(PAL)檢測試劑盒(苯微板法)

苯丙氨解氨酶( L－phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脫掉L-苯丙上的氨而生成反式桂皮酸的酶，

該酶多存在于高等植物、酵母、菌類可溶性部分物質(zhì)，是1961年J.Koukol在大麥中發(fā)現(xiàn)的，推測其分子量約為30萬，

這是一個可把苯丙氨用于酚類化合物合成的酶。在組織中的活性可隨外界因素而發(fā)生顯著變化，用光照、病傷害、

植物激素處理等會使活性顯著增加，在多數(shù)情況下在組織中活性增加時，酶發(fā)生失活作用，這時組織中具有活性酶的

量很快就會減少，據(jù)認(rèn)為這種失活是與類蛋白質(zhì)物質(zhì)作用有關(guān)，測定細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間代謝物及關(guān)鍵酶活性，

可以探討多種生物細(xì)胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細(xì)胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。

(PAL)檢測試劑盒(苯微板法)檢測原理是以苯丙氨作為底物，在酶促反應(yīng)的最適條件下采用每隔

一定時間測定產(chǎn)物生成量的方法，于酶標(biāo)儀290nm處檢測吸光度，以吸光度變化所需酶量進(jìn)行計算，主要用于植物組織的裂解

液或勻漿液、血清等樣品中內(nèi)源性的苯丙氨解氨酶活性，尤其適用于檢測水果中苯丙氨解氨酶活性。該試劑盒僅用于科研

領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。

操作步驟(僅供參考)：

自備材料：

1、蒸餾水

2、電子天平、研缽或勻漿器、離心管或試管

3、低溫離心機、恒溫箱或水浴鍋、酶標(biāo)儀、酶標(biāo)板

操作步驟(僅供參考)：

1、準(zhǔn)備樣品∶

①植物樣品︰取1g植物組織或水果中層果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情況下充分搗碎研磨或勻漿，4℃ 10000r/min

離心15~20min，留取上清液，-20℃凍存，用于苯丙氨解氨酶的檢測。

②血漿、血清和尿液樣品︰血漿、血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于該試劑盒的測定，-20℃凍存，用于苯丙解氨的檢測。

③細(xì)胞或組織樣品∶取恰當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液，如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，4℃ 10000r/min離心15~20min，取上清液，

-20℃凍存，用于苯丙酸解氨酶的檢測。④高活性樣品︰如果樣品中含有較高活性的苯丙解氨酶，可以使用蒸餾水或PAL

Lysis Buffer稀釋進(jìn)行恰當(dāng)?shù)南♂尅?/span>

2、PAL加樣∶

取96孔板，按照下表設(shè)置對照孔、測定孔，溶液應(yīng)按照順序依次加入，并

注意避免產(chǎn)生氣泡。如果樣品中的PAL活性過高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測定，樣品的檢測最好能設(shè)置2平行孔，

求平均值。

加入物（μl）對照孔測定孔

蒸餾水150100

待測樣本5050

PAL Assay Buffer-50

3、PAL檢測︰

以對照孔為對照(調(diào)零)，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為   A測定0);40℃準(zhǔn)確孵育1h，立即加入10μl PAL終止

液終止反應(yīng)(備選方案)，以對照孔為對照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定孔的吸光度(記為A測定1)。

注意︰加入PAL終止液終止反應(yīng)為非必須步驟，可37℃準(zhǔn)確孵育1h后直接以對照孔為對照調(diào)零，酶標(biāo)儀立即測定290nm處測定

孔的吸光度。

注意事項∶

1、待測樣品中不能含有酶抑制劑，同時需避免反復(fù)凍融。

2、獲得上清液為PAL酶液，應(yīng)盡快檢測，亦可-20°℃保存。

3、如果沒有可測定紫外區(qū)的酶標(biāo)儀和酶標(biāo)板，也可以使用紫外分光光度計和石英比色皿，但應(yīng)注意比色杯的最小檢測體積。

4、每次檢測指標(biāo)不宜過多，否則操作時間不一，有可能導(dǎo)致樣本間的差異。5、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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