PCR 實(shí)用技巧——消除引物二聚體的方法

接下來就讓我?guī)Т蠹易哌M(jìn)它的世界，了解它，認(rèn)識它，最后戰(zhàn)勝它。

引物二聚體是什么鬼？

引物二聚體其實(shí)就是一對引物或者引物自身的 3’ 端部分堿基互補(bǔ)結(jié)合，在 Taq 酶的作用下從 3’ 末端延伸所形成的小分子量的雙鏈 DNA 片段。

引物二聚體是如何形成的？

1）最根本的原因是引物之間或者引物自身 3’ 端部分堿基互補(bǔ)結(jié)合

2）模板量過低

3）引物濃度過大

4）引物長度過短

5）退火溫度低

如何區(qū)分引物二聚體和目的條帶？

因為引物二聚體的大小從幾十 bp 至幾百 bp 不等，所以當(dāng)你的目的條帶的分子量比較小的時候，電泳后所看到的結(jié)果不一定是目的條帶，很有可能是引物二聚體，所以我們需要一個有效的方法來區(qū)分二者。

當(dāng)我們對引物二聚體形成的本質(zhì)了解了之后，想要區(qū)分二者其實(shí)并不難，我相信大家看到這里的時候已經(jīng)知道了引物二聚體形成的本質(zhì)了，但是我還要強(qiáng)調(diào)一遍：引物二聚體形成的本質(zhì)其實(shí)就是引物之間或者引物自身的 3’ 端區(qū)域存在部分互補(bǔ)結(jié)合。

也就是說，引物的形成是不需要模板的參與的，所以我們只需要在電泳的時候添加一組對照就可以有效的判斷是否有引物二聚體的形成，以及如果有引物二聚體的形成，它的分子量是多大，從而區(qū)分開引物二聚體和目的產(chǎn)物。

這個對照就是：模板用 H2O 替代，其他的都一樣。這樣的話，如果這個泳道有條帶出現(xiàn)，那說明形成了引物二聚體（當(dāng)然前提就是該體系沒有被模板污染）。從這里也可以看出設(shè)置對照的重要性，一個巧妙的對照往往可以達(dá)到事半功倍的效果。

如何消除引物二聚體？

1）重新設(shè)計引物，這是解決該問題最根本的辦法

2）增加模板用量

3）減小引物濃度

4）引物長度適中

5）提高退火溫度

6）減少循環(huán)次數(shù)

7）可以適當(dāng)?shù)脑?Mix 中添加少量的甘油或 DMSO

最后，希望大家在讀了該篇文章后，引物二聚體可以永遠(yuǎn)離你而去！

最后的最后，給大家補(bǔ)充一個好的點(diǎn)子：基本上消滅二聚體，最核心的注意是

3'尾巴的三個堿基最好不要全部是 G 或 C 組成的

3'尾巴的三個堿基的互補(bǔ)序列不要出現(xiàn)在兩條引物序列里