PCR技術--污染與對策

PCR反應的最大特點是具有較大擴增能力與靈敏性高，但令人頭痛的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。

一、污染原因

(一)標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于 密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提 取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠 或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染。

(三)PCR擴增產物污染。這是PCR反應中最主要最常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量 大(一般為1013拷貝/ml)，遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物 污染，就可造成假陽就可形成假陽性。

還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩 擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣 槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由 其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

(四)實驗室中克隆質粒的污染:在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的 檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化 過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡 便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。

二、污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施，防止和消除污染。

對照試驗

1、陽性對照:在建立PCR反應實驗室及一般的檢驗單位都應設有PCR陽性對照，它是PCR 反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性 對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產物的標本，如以重組質粒為陽 性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質粒及高濃度陽 性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設陽性對照。

2、陰性對照:每次PCR實驗務必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用 鑒定后的正常血清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞作對照。②試劑 對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。

3、重復性試驗

4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增

三、防止污染的方法

(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產物的鑒定 等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。 最好能劃分①標本處理區(qū)；②PCR反應液制備區(qū)；③PCR循環(huán)擴增區(qū)；④PCR產物鑒定區(qū)。 其實驗用品及吸樣槍應專用。實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA.

(二)吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸 入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心，吸 樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠污染。

(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，如有可能，PCR反應液應預先 配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一 冰箱。

(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。

(五)設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃詫φ找阅艹霈F(xiàn)擴增條帶的低量的標準病 原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照 及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。

(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產物達到檢測水平就適可而止。

(七)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前 應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。