Equine Herpesvirus 5 (EHV-5)馬皰疹病毒5型染料法熒光定量PCR試劑盒應用

背景：皰疹病毒(herpes virus)是一群有包膜的DNA病毒，生物學特性相似，歸類為皰疹病毒科(Herpesviridae)。其感染宿主廣泛，主要侵害皮膚、黏膜以及神經組織，嚴重影響著人及其他動物的健康。馬可能感染多種皰疹病毒。最常見的與感冒病毒相似，易致呼吸困難。馬皰疹病毒4型(EHV-4)也稱馬鼻肺炎病毒，主要引起呼吸系統疾病。因此靈敏快捷的診斷產品具有重要的意義。

產品及特點    

本產品是根據探針法熒光定量 PCR 原理開發的檢測試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物等組分經過優化，靈敏度高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據中間普雷沃菌 DNA 序列高度保守區設計，不會跟其他生物樣本的DNA發生交叉反應。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

7. 本產品只能用于科研

使用方法：

一、DNA 提取(樣本制備區)

用自選方法提取純化樣品DNA，本試劑盒跟市場上大多數核酸提取試劑盒兼容。

二、稀釋標準曲線樣品(樣本制備區)

 （由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，避免污染樣品或本試劑盒的其他成分）。

1. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL DEPC-H2O，（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

若無需制作標準曲線，將陽性對照稀釋到1×10E5拷貝/μL即可。

三、試劑配制(試劑準備區)

若有N個待檢樣品，準備N+2個qPCR管(N個待檢樣品+1個陰性對照+6個陽性對照)，向各PCR管中分別加入下列成分(見詳細說明書，可向我司索取)

轉移至樣本準備區。

四、添加模板(模板添加區)

向qPCR管中分別加入2ul模板，加樣順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣品模板、嬰兒利什曼蟲qPCR陽性對照，離心30秒，立即進行擴增反應。

五、擴增反應(擴增及產物分析區)

將PCR管放置在PCR擴增儀器樣品槽相應位置，進行擴增，擴增程序如下：(見詳細說明書，可向我司索取)

六、結果分析

1. 如果制作標準曲線，則以陽性對照濃度的log 值為橫軸，以Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的log 值，推算出其濃度。

2. 如果未制作標準曲線，按照如下標準判定結果：

陽性對照結果：Ct 值<30，有明顯指數增長，呈典型的S 型曲線。

陰性對照結果：Ct 值>38 或無Ct 值，無明顯指數增長期和平臺期。

樣本檢測結果：Ct 值<35，有明顯指數增長，表明樣本中檢測出嬰兒利什曼蟲，結果為陽性；Ct 值>38 或無Ct 值，表明樣本中未檢測出嬰兒利什曼蟲，結果為陰性；Ct值在35-38 范圍，應對樣本進行復檢，如重復實驗結果Ct 值仍在35-38 范圍，有明顯指數增長，則判定為陽性，否則為陰性。

運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。