免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟解析

1．固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。對(duì)于冰凍切片，甲醛固定有時(shí)比冰凍丙酮好；但對(duì)于不同的組織和抗原，可選用不同的固定液。 有時(shí)候商品化的抗體會(huì)有比較適合而推薦的固定液，請(qǐng)于購(gòu)置前注意說(shuō)明書。

Bouin S固定液：飽和ku味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)，固定較好，結(jié)構(gòu)完整，但因偏酸，對(duì)抗原有一定損害，且組織收縮明顯，不適于組織標(biāo)本的長(zhǎng)期保存。

PLP液：即高碘酸鈉-賴氨酸-多聚甲醛，適于固定石蠟切片。適于富含糖類組織，對(duì)超微結(jié)構(gòu)及許多抗原的抗原性保存較好。

2．組織脫水，透明：時(shí)間不能太長(zhǎng)，否則在切片時(shí)容易碎片，切不完整。

3．切片時(shí)展片：有些組織在切片后難以在水中展開(kāi)，這時(shí)可適當(dāng)?shù)卦谒屑尤霂椎我掖肌?/span>

4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過(guò)夜，溫度太高或時(shí)間太長(zhǎng)，抗原容易丟失。

5．蠟塊及切片的保存：最好在4℃保存

6．脫片問(wèn)題： Poly-L-Lysine(多聚賴氨酸)為目前免疫組化染色工作中常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。

7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。

8．暴露抗原：對(duì)于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時(shí)，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度(不同抗體的最佳修復(fù)液請(qǐng)參閱抗體說(shuō)明書)。對(duì)于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時(shí)，可延長(zhǎng)封閉時(shí)間或用濃縮血清封閉

10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配"的原則，對(duì)于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。

12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na₂HPO₄的飽和溶液返藍(lán)。

13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14．在整個(gè)操作過(guò)程中，切片千萬(wàn)不能干燥，否則會(huì)有非特異性染色。