H1人胚胎干細胞實驗操作流程

H1人胚胎干細胞培養準備

一.試劑準備

1)hESC/iPSC培養基配制(500 mL)

1. 在4條件下解凍hESC/iPSC Grouth Supplements A/B，勿在37培養箱/水浴鍋解凍。

2. 參考表1在生物安全柜中，使用無菌移液管混勻下列成分配制成hESC/iPSC培養基，之后置于4儲存，封口膜封好后2周內使用。

3. 有初培養需擴建的需求，建議先配置100 mL,保證2周內使用完畢。

2)Matrigel鋪板(以貨號為354277的Corning Matrigel包被6孔板為例)

A. 分裝 Matrigel

1. 貨號354277的Matrigel，操作說明中不標注蛋白濃度，而是以Dilution Factor表示，如某批次的推薦Dilution Factor為278 μL，則表明278 μL可包被4塊6孔板，分裝數量=5 mL /0.278=17.98。

2. 準備18個無菌1.5 mL EP管，標記Matrigel日期、操作人;1mL無菌吸頭;EP管架，均置于-20冰箱中預冷1小時。

3. 將Matrigel放置4冰箱過夜解凍，當Matrigel解凍即可開始分裝。

注：在解凍時，將Matrigel放置冰箱內側角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1.5 mL EP管及EP管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻Matrigel，無菌分裝于各個1.5 mL EP管中，并置于冰上。當吸頭被堵塞可能導致分裝體積不準時需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取36 mL冷藏DMEM/F12于50 mL離心管中，準備4個6孔板，標記Matrigel、批號、日期和操作人。

2. 1 mL無菌吸頭置于-20冰箱中預冷1小時，取出一支冷凍的Matrigel(5mL)置于4冰箱解凍至化凍。

3. 準備一個裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的Matrigel、預冷的1mL吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預冷吸頭向解凍過的Matrigel(5mL)加入1 mL冷的DMEM/F12并反復吹打解凍混勻。

5. 吸出已解凍混勻的Matrigel加入離心管中剩余的DMEM/F12，使用10 mL移液管再次反復吹打混勻。

6. 分裝1.5 mL/孔于4個六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養板置于室溫1小時后即可使用，或置于4冷藏過夜，兩周內使用。

H1人胚胎干細胞培養操作

1)H1人胚胎干細胞復蘇步驟(以6孔板為例)

1. 將水浴鍋預熱至37；并將Matrigel包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫(15~30)。

2. 取4 mL hESC/iPSC培養基，按照1:4000比例加入1 μL的hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫(15~30)。

注意：不要在37水浴鍋中預溫培養基。

3. 取出1支冷凍的細胞置于37水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min內解凍，肉眼觀察細胞懸液內冰晶即將消失時取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉入生物安全柜;將細胞懸液移到事先準備好的15 mL 離心管中，隨后緩慢逐滴加入10mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細胞，160g離心5 min。

5. 吸棄上清，加入預溫的4 mL的hESC/iPSC培養基+hESC/iPSC Supplement C制備細胞懸液，盡量避免吹打。

注：可留20 μL上清液，輕彈管底，使細胞懸浮液更均勻，避免成較大細胞團。

6. 吸除6孔板中2孔的Matrigel包被液，將細胞懸液按照2 mL/孔接種到1個孔中。

7 水平十字搖勻三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養箱中，再次水平十字搖勻三次培養。

8. 18-24小時后換新的hESC/iPSC培養基，之后每天更換培養基。

注：在hESC(H1)培養過程中，如果細胞的匯合度超過50%，建議更換培養基時，培養基的體積增加至3-4mL/孔。

培養容器(孔數)底面積DPBS (mL)EDTA傳代工作液hPSC培養基*

2)H1人胚胎干細胞傳代步驟(以6孔板為例)

1. 傳代條件：① H1人胚胎干細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)，一般情況下每3-4天傳代;

② H1人胚胎干細胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團較小、匯合度不足，也建議不要連續培養超過5天。

2. 傳代比例：可根據細胞生長狀態和實驗需要按1:5~1:12的比例進行傳代，如果細胞正常，克隆團匯合度85%，大小均勻(如圖1(C-D)所示)，建議按照1:8進行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例;密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8傳代就是1個孔瓶傳8個孔(以6孔板為例)。

3. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫(~25)。

4. 根據傳代接種的孔數準備2 mL/孔的hESC/iPSC培養基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫(~25)。

5. 將 Matrigel 包被的6孔板，提前放置生物安全柜中約1小時恢復至室溫(~25)。

6. 根據傳代接種的孔數準備2 mL/孔的hESC/iPSC培養基，并按1：4000比例加入hESC/iPSC Supplement C，恢復至室溫(~25)。

7. 將孔內培養基吸取，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃并吸取。

8. 加入2 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution使溶液覆蓋孔底。

9. 置于37培養箱中孵育8-9 min。

注：① 消化8-9 min后鏡下觀察細胞變化，當大部分細胞變亮變圓，且細胞尚未脫離基質或漂起時即可終止消化，若大部分細胞仍未變亮，則需要延長消化時間;

② 保持6孔板與培養箱金屬隔板直接接觸，使6孔板受熱均勻，不要疊放。

10. 消化結束后輕輕地將細胞培養板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細胞，傾斜并吸除hESC/iPSC Passage Solution。

11. 及時加入2 mL/孔預溫的hESC/iPSC培養基+ hESC/iPSC Supplement C，水平十字搖晃6孔板使細胞脫離基質。

注：① 加hESC/iPSC培養基 + hESC/iPSC Supplement C時，可輕柔吹打細胞1-2次，不能超過2次，避免反復吹打；有部分細胞(10%～15%)未脫離基質是正常現象，若有大量細胞未脫離則需延長消化時間(< 10min)。

②hESC(H1)細胞不能長時間處于hESC/iPSC Passage Solution(<15 min)，所以收集接種細胞時操作必須快速,以及最好一次操作不要超過4孔(六孔板)。

12. 吸取6孔板中的Matrigel溶液，加入預溫的hESC/iPSC培養基+ hESC/iPSC Supplement C 2 mL/孔。

13. 在6孔板上標記細胞名稱、代次、傳代比例、日期、操作人。將步驟9獲得的細胞懸液輕輕搖勻，按預先設定的傳代比例均勻分配于孔板中。

注：為了鋪板均勻并降低對細胞的損傷，可以將步驟9獲得的細胞懸液收集至2mL離心管，輕柔顛倒混勻細胞1-2次;再按照傳代比例接種。

14. 接種后，水平十字搖勻6孔板三次，置于37，5% CO2濃度，飽和濕度的培養箱中， 再次水平十字搖勻6孔板三次，培養過夜。

15. 18-24小時后更換新hESC/iPSC培養基，此后每天換液，4-5天后繼續傳代/凍存。

3)H1人胚胎干細胞凍存步驟(以6孔板為例)

1. 當H1人胚胎干細胞匯合度達85%左右(如圖1(C-D)所示)可收獲凍存，一般6孔板每孔可凍存1管。

2. 準備相應數量的1.5/2 mL凍存管，標記細胞名稱、代次(P#)、日期、操作人。

3. 取出4冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入2 mL/孔的DPBS(不含鈣鎂)，輕輕搖晃數次，再吸取。

5. 加入2 mL/孔的hESC/iPSC Passage Solution，將細胞置于37培養箱中，計時8-9 min(可參考“六、傳代hESC/iPSC"步驟)。

6. 消化結束，輕輕取出培養板，吸取hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預溫的hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入1 mL凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻3次，隨后吸取細胞懸液加入1.5/2 mL凍存管中。

8. 將細胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80冰箱中過夜，次日轉入液氮罐中長期保存。

H1人胚胎干細胞培養時需避免的操作失誤

1.細胞培養時要規范標準

通常培養細胞時會出現污染等問題很大程度原因是由于我們在培養細胞時操作方法不夠標準沒有處理好所造成的，因此在培養細胞時需要加強操作規范。

(1)嚴格控制無菌操作。在培養設備和耗材都準備好以后就要做好日常的消毒工作嚴格控制細菌、真菌、微生物等常見的污染。如果條件有限的情況下可以在培養基中添加適當的抗生素來防止污染但是這往往會影響到細胞的培養因此要謹慎。

(2)培養環境需要每日觀察。特別是很多細胞培養時都會在培養箱中進行，其中溫度、適度以及二氧化碳的濃度都會有嚴格的要求，如果在培養時設備中的環境出現了偏差那么細胞培養時自然會出現問題，因此在培養時應當嚴格檢測好培養設備及環境。

(3)細胞培養基及相關試劑的選擇。培養時會用到培養基、血清、試劑等物品但是選擇的產品應該是優質產品，劣質的產品往往技術不過關其中包含很多有害物質因此不建議不夠。

H1人胚胎干細胞注意事項

1. 收到H1人胚胎干細胞后首先觀察細胞瓶是否完好，培養液是否有漏液、渾濁等現象，干冰運輸的細胞檢查干冰是否揮發，細胞是否解凍，若有上述現象發生請及時和我們聯系。

2. 仔細閱讀H1人胚胎干細胞說明書，了解細胞相關信息，如細胞形態、所用培養基、血清比例、所需細胞因子等，確保細胞培養條件一致，若由于培養條件不一致而導致細胞出現問題，責任由客戶自行承擔。

3. 請客戶用相同條件的培養基用于細胞培養。

4. 建議客戶復蘇細胞后前3天各拍幾張細胞照片，記錄細胞狀態，便于和我司技術部溝通交流。由于運輸的原因，細胞會出現不穩定的情況，請及時和我們聯系，告知細胞的具體情況，以便我們的技術人員跟蹤回訪直至問題解決。