PCR和凝膠電泳實驗常見問題及原因分析

PCR和凝膠電泳實驗常見問題及原因分析

為了排除某些因素對PCR結果的影響，PCR實驗需要對照實驗。PCR的陽性對照是Marker，推測PCR產(chǎn)物長度，判斷PCR產(chǎn)物是否是目的

片段。PCR的陰性對照是PCR的空白管，除了模板不加之外，其成分與其他管一樣，證明沒有其他模板污染。

由于目前所用的PCR儀器自動化程度較低，操作步驟較為繁雜，人為因素大，這就不可避免地會出現(xiàn)不同程度的誤差。輕微的污染

、加量的誤差等均可導致結果較大的差異，甚至陽性和陰性出現(xiàn)兩種迥然不同的結果。在分析測定工作中系統(tǒng)誤差產(chǎn)生的原因主要有：

方法誤差、儀器誤差、人員誤差、環(huán)境誤差、試劑誤差等。本期我給大家搜集了一些平時經(jīng)常性遇到的一些問題，希望對大家有所幫助。

要分析遇到的問題，除了考慮必要的儀器外，需要明確PCR（聚合酶鏈反應）的基本要素：

引物：這些是特別設計的短DNA序列，作為DNA合成的起始點，針對目標DNA的兩端進行互補配對。引物長度一般在20到30個核苷酸之間。

DNA聚合酶：以Taq聚合酶為代表的酶類，負責新DNA鏈的合成。Taq聚合酶能夠在引物附著的地方開始工作，通過逐一添加核苷酸來延長

DNA鏈。這種聚合酶能夠耐受PCR過程中必需的高溫條件，這是因為它來源于能在熱水環(huán)境中生存的微生物。

脫氧核苷酸三磷酸（dNTPs）：這些分子提供了新DNA鏈合成的原料，包括四種類型：dATP、dCTP、dGTP和dTTP。在PCR過程中，

Taq聚合酶利用這些dNTPs來逐步構建新的DNA鏈。

目標DNA提取：實驗開始之前，首先需要從樣本中提取出所要研究的DNA片段。

緩沖溶液：提供適宜的反應環(huán)境，確保PCR反應能夠有效進行。

氯化鎂（MgCl2）：作為Taq聚合酶活性的輔助因子，對于酶的功能至關重要。

1.耗材選擇不當對實驗結果造成很大的影響

PCR耗材一般都是聚丙烯（PP）材質(zhì)，因其為生物學惰性材料，表面不易于粘附生物分子，且有著良好的化學耐性，及溫度耐受性

（可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化）。這些材料通常會與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用

高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。

PCR管的體積大多數(shù)都可以滿足PCR反應要求。但是在滿足實驗要求的基礎上，優(yōu)先推薦選用低容管。因為低容反應管有著較小的上方空間，

可提高熱傳導率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時，需要避免加樣過量或過少。過量會導致熱傳導率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會

造成樣品蒸發(fā)損失。

2.假陰性（無擴增產(chǎn)物）——現(xiàn)象：陽性對照有條帶，而樣品則無

原因：模板含有抑制物，含量低；緩沖液（Buffer）對樣品不合適；引物設計不當或者發(fā)生降解；反應條件：退火溫度太高，延伸時間太短。

對策：純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量；更換Buffer或調(diào)整濃度；重新設計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結構）

或者換一管新引物；降低退火溫度、延長延伸時間。

3.非特異性擴增 ——條帶與預計的大小不一致或者非特異性擴增帶

原因：引物的特異性不強、提取模板DNA中可能會有非靶基因性同源序列；模板或引物濃度過高；酶量過多；Mg2+濃度偏高；

退火溫度偏低；循環(huán)次數(shù)過多。

對策：重新設計引物；適當降低模板或引物濃度；適當減少酶量；降低鎂離子濃度；適當提高退火溫度則減少與同源性非靶DNA的互補程度；

減少循環(huán)次數(shù)。

4.拖尾——產(chǎn)物在凝膠上呈模糊不清狀態(tài)（彌散）

原因：模板不純；引物濃度不夠優(yōu)化；Buffer不合適；退火溫度偏低；.酶量過多；dNTP、Mg2+濃度偏高；循環(huán)次數(shù)過多。

對策：純化模板；對引物進行梯度稀釋；更換Buffer；適當提高退火溫度；適量用酶；適當降低dNTP和鎂離子的濃度；減少循環(huán)次數(shù)。

5.假陽性——空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物

原因：出現(xiàn)假陽性最大的可能性是污染有非樣品性靶基因，特別是進行大量檢測或經(jīng)常性針對同一種靶基因的擴增試驗時，如稍不慎重，

就會導致樣品間的交叉污染及實驗室的“隨帶性"污染。出現(xiàn)假陽性結果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列，

這在基因組DNA中擴增特異片段時應特別注意，對于樣品間的交叉污染，實驗室的隨帶污染、避免假陽性關鍵在于提高警惕慎重操作。

對策：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應高壓消毒。

所用離心管及加樣槍頭等均應一次性使用；各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存 。